Biofilm e resistenza degli stafilococchi coagulasi negativi ad antibiotici e disinfettanti [prima parte].
Gli stafilococchi coagulasi negativi (CNS) sono considerati agenti patogeni minori per quanto riguarda la patogenesi della mastite. Tuttavia essi rappresentano il gruppo di batteri più frequentemente isolati nei campioni di latte prelevati da bovine affette da mastite sia in Canada sia in altri paesi. Staphylococcus Chromogenes e Staphylococcus simulans sono le specie più frequentemente associate a infezioni mammarie causate da CNS, ma più di una dozzina di specie sono state isolate da campioni di latte bovino. L’interesse nei confronti degli stafilococchi coagulasi negativi è aumentata negli ultimi anni e questi batteri sono considerati da alcuni come agenti eziologici emergenti per quanto riguarda la mastite. Inoltre, il ruolo nella patogenesi della mastite assunto dal biofilm formato dagli stafilococchi coagulasi negativi è oggetto di molti recenti studi.
Il biofilm è definito come una comunità strutturata di cellule batteriche racchiusa in una matrice autoprodotta che aderisce alle superfici di natura organica o inorganica. La capacità di dare origine al biofilm, comune a molte specie di CNS, non è associata a un aumento della gravità della malattia; tuttavia, una forte associazione positiva tra i giorni in lattazione e la quantità di biofilm prodotto è stata osservata in vitro, suggerendo che il biofilm sia in grado di favorire la persistenza degli stafilococchi coagulasi negativi a livello di parenchima della ghiandola mammaria.
Dato che il biofilm offre protezione contro l’azione degli antibiotici e dei disinfettanti, la sua presenza in mammella al termine della lattazione o nell’ambiente potrebbe avere un impatto sulla terapia e sulla prevenzione delle infezioni mammarie.
Diversi studi hanno dimostrato che più della metà degli stafilococchi coagulasi negativi, isolati dal latte di bovine affette da mastite, è resistente a uno o più antibiotici. Tuttavia questi dati sono molto variabili da paese a paese e anche secondo il periodo.
Anche se è noto che la presenza del biofilm può aumentare la resistenza dei batteri all’azione degli antibiotici e dei disinfettanti, l’effetto della formazione di tale biofilm da parte dei batteri isolati dal latte prodotto da bovine affette da mastite non è stato sufficientemente approfondito e i pochi studi disponibili in letteratura si focalizzato sull’effetto del biofilm prodotto da Stafilococcus aureus. Tali studi hanno comunque dimostrato le cellule batteriche circondate dal biofilm sono più resistenti all’azione degli antibiotici e dei disinfettanti rispetto alle cellule degli stessi batteri non circondate dal biofilm.
L’obiettivo dello studio riassunto in quest’articolo è di valutare l’effetto della formazione del biofilm da parte degli stafilococchi coagulasi negativi sulla sensibilità di tali batteri agli antibiotici e ai disinfettanti.
Per raggiungere tale obiettivo sono state isolate quindici colonie di stafilococchi coagulasi negativi dal latte prodotto da bovine non affette da mastite in diversi momenti della lattazione. Per ciascuna colonia sono state determinate:
– La sensibilità delle colonie isolate ai seguenti principi attivi antibiotici: ampicillina, ceftiofur, cefalotina, eritromicina, oxacillina, penicillina, penicillina/novobiocina, sulfadimetossina e tetraciclina. La concentrazione minima inibente (MIC) è stata determinata facendo riferimento alla concentrazione minima di antibiotico che impediva la crescita visibile delle colonie batteriche testate.
– La concentrazione minima dei diversi antibiotici in grado di inibire la formazione del biofim.
– Il tempo minimo di contatto necessario a tre diversi disinfettanti per rimuovere le cellule batteriche prive di biofilm. In questo test sono stati utilizzati tre disinfettanti comunemente utilizzati durante il post-dipping contenenti rispettivamente: iodio all’1%, iodio allo 0,4% e clorexidina allo 0,5%.
– Lo stesso test è stato eseguito su colonie di CNS caratterizzate dalla presenza di biofilm.
– Sono stati poi valutati, utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, gli effetti dei disinfettanti sulla struttura microscopica del biofilm prodotto dalle colonie studiate.
I risultati dello studio in oggetto sono riportati di seguito:
– Gli stafilococchi coagulasi negativi in grado di creare un biofilm più abbondante non sono più resistenti agli antibiotici rispetto a quelli che creano un biofilm più sottile.
– Le cellule batteriche circondate da biofilm sono meno suscettibili all’azione degli antibiotici comunemente utilizzati rispetto alle medesime cellule prive di biofilm. Per determinare se la formazione del biofilm da parte dei CNS diminuisce la loro sensibilità nei confronti degli antibiotici, i CNS caratterizzati da un’abbondante produzione di biofilm sono stati esposti a una combinazione di penicillina G/novobiocina e al ceftiofur. Questi principi attivi sono stati selezionati perché appartengono alle classi di antibiotici più comunemente utilizzate negli allevamenti canadesi in cui sono allevate le bovine dal cui latte sono stati isolati i batteri oggetto di studio. Tutte le colonie con biofilm sono risultate essere più resistenti sia all’associazione penicillina G/novobiocina sia al ceftiofur. Nel dettaglio le cellule batteriche dotate di biofilm sono risultate essere da 4 a 256 volte più resistenti all’azione antibiotica del ceftiofur e da 16 a 612 volte più resistenti all’azione della penicillina G in associazione alle novobiocina rispetto alle cellule omologhe ma prive di biofilm.
Per determinare se la combinazione penicillina G/novobiocina è maggiormente efficace contro i CNS dotati di biofilm rispetto ai due antibiotici presi singolarmente, gli stafilococchi coagulasi negativi dotati di biofilm sono stati esposti a penicillina G e novobiocina senza associare i due principi attivi. I risultati hanno dimostrato che batteri dotati di biofilm sono ancora più resistenti ai due principi attivi utilizzati singolarmente rispetto ai batteri omologhi privi di biofilm. Infatti, le cellule batteriche dotate di biofilm sono risultate essere da 16 a 1028 volte più resistenti all’azione antibiotica della penicillina 6 e da 32 a 2048 volte più resistenti all’azione della novobiocina rispetto alle cellule omologhe ma prive di biofilm.
Fonte: Biofilm formation by coagulase-negative staphylococci: impact on the efficacy of antimicrobials and disinfectants commonly used on dairy farms. Yannick D.N. Tremblay, Vincent Caron, Andre´anne Blondeau, Serge Messier, Mario Jacques. Veterinary Microbiology 172 (2014) 511–518.